Ottimizzazione di un massimo

Rapporti scientifici volume 13, numero articolo: 4588 (2023) Citare questo articolo

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Sono necessari strumenti sensibili per rilevare sierotipi pneumococcici colonizzatori concomitanti per una valutazione dettagliata dell’impatto diretto e indiretto dell’immunizzazione di routine con vaccino pneumococcico coniugato (PCV). È stato sviluppato un set di reazioni PCR nanofluidica in tempo reale quantitativa ad alta produttività (Standard BioTools "Fluidigm") per rilevare e quantificare 92 sierotipi di pneumococco in campioni clinici archiviati. Per il confronto sono stati utilizzati tamponi nasofaringei raccolti nel 2009-2011 da bambini sudafricani di età ≤ 5 anni, precedentemente sierotipizzati con metodi standard basati sulla coltura. Il set di reazioni all'interno del "Fluidigm" ha amplificato efficacemente tutti i target con elevata efficienza (90–110%), riproducibilità (R2 ≥ 0,98) e con limite di rilevamento basso (< 102 CFU/ml). Un'analisi in cieco di 1.973 campioni di tampone nasofaringeo ha mostrato una sensibilità diagnostica > 80% e una specificità > 95% rispetto al metodo Quellung basato sulla coltura standard di riferimento. Il metodo qPCR è stato in grado di sierotipizzare i tipi di pneumococco con una buona discriminazione rispetto a Quellung (ROC-AUC: > 0,73). Il metodo PCR nanofluidico in tempo reale ad alta produttività rileva simultaneamente 57 sierotipi individuali e 35 sierotipi all'interno di 16 sierogruppi in 96 campioni (compresi i controlli), all'interno di una singola corsa qPCR. Questo metodo può essere utilizzato per valutare l’impatto delle attuali formulazioni di PCV sulla colonizzazione del sierotipo vaccinale e di quello non vaccinale, compreso il rilevamento di più sierotipi colonizzanti contemporaneamente. Il nostro metodo qPCR può consentire il monitoraggio della carica batterica sierotipo-specifica, nonché l'emergenza o la trasmissione in corso di sierotipi minori o co-colonizzati che potrebbero avere un potenziale di malattia invasiva.

La capsula dello Streptococcus pneumoniae è composta da polisaccaridi ripetuti geneticamente codificati dal locus di sintesi dei polisaccaridi capsulari (CPS) che conferisce eterogeneità del sierotipo1,2. Esistono 100 sierotipi di S. pneumoniae distinti dal punto di vista biochimico e sierologico3. La diversità capsulare è un importante fattore di virulenza in S. pneumoniae4 e i sierotipi hanno un diverso potenziale di causare malattie nell'uomo5. I vaccini pneumococcici coniugati (PCV) prevengono l'acquisizione del portatore del sierotipo vaccinale pneumococcico (VT), che è un precursore della malattia6,7,8,9,10. Il primo PCV concesso in licenza (PCV7) mirava a sette sierotipi, vale a dire: 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F e 23F. Gli attuali PCV in uso nel nostro contesto includono altri tre sierotipi (PCV10: 1, 5 e 7F) e sei (PCV13: 1, 3, 5, 6A, 7F e 19A). I PCV 15 e 20-valenti di nuova generazione sono in fase di sperimentazione clinica e includono rispettivamente due (22F e 33F)11 e sette (8, 10A, 11A, 12F, 15B, 22F e 33F)12 sierotipi aggiuntivi rispetto al PCV13.

La sorveglianza della colonizzazione da pneumococchi delle vie aeree superiori è utile per valutare l'impatto dell'immunizzazione contro il PCV a livello di popolazione13. Le indagini sulla colonizzazione pneumococcica vengono eseguite al meglio utilizzando metodi di sierotipizzazione completi, sensibili e accurati in grado di rilevare la co-trasporto di più sierotipi, inclusi VT e sierotipi non vaccinali (NVT). È necessaria una sorveglianza coerente dei sierotipi circolanti per informare le strategie di vaccinazione e l’utilizzo di PCV a valenza superiore o alternativa, anche adattati alle diverse regioni geografiche; e per l'individuazione di sierotipi emergenti o sostitutivi13.

I metodi Quellung basati sulla coltura rimangono il gold standard per la sierotipizzazione di S. pneumoniae; tuttavia, questi metodi richiedono molto tempo, sono poco sensibili e sono costosi14,15. Rispetto ai metodi basati sulla coltura, il rilevamento e la sierotipizzazione basati sulla reazione a catena della polimerasi (PCR) non si basano sulla vitalità dell'organismo che può essere influenzata negativamente dall'uso di antibiotici, dalle condizioni di trasporto e conservazione del campione, richiedono meno tempo, forniscono diagnosi più rapide e maggiore sensibilità15 . Sono state utilizzate PCR convenzionali e in tempo reale, comprese PCR annidate e multiplex a tubo singolo con elettroforesi su gel o capillare e combinate con rilevamento dot-blot, arricchimento della coltura e analisi basata sul sequenziamento16,17,18,19,20,21,22, 23,24,25,26,27,28. Sono stati sviluppati metodi PCR in tempo reale con un numero crescente di sierotipi rilevati21,29,30,31, anche in sistemi ad alta produttività15,32,33. Inoltre, i metodi PCR quantitativi (qPCR) convalidati per determinare la carica batterica29,31,32,34 sono importanti per valutare l’impatto dei vaccini nei programmi di sanità pubblica. L'aumento della carica batterica nel rinofaringe può predire il potenziale di una malattia invasiva sierotipo-specifica31.

0.98, Table 1), allowing for relative quantification of bacterial load using the slope of the linear equation. The linear dynamic range for these assay-sets was at least 5-log fold. Further, Levy-Jennings plots constructed using assay-set specific reference calibrators were within ± 2.0 SD of the mean Cq value across all plates. This validated the use of the designed calibrators (gBlocks). The assay-sets for the detection of E. coli, Pneumocystis jiroveci, S. algalactiae, the Xisco gene of S. pneumoniae and the Bacterial 16S ribosomal RNA gene (listed in Supplementary Table S1) did not perform well within this reaction-set, as the efficiency was < 90% or > 110% or r2 < 0.98 (Supplementary Table S5)./p> 80% sensitivity (Table 3) in the 1 973 archived clinical samples for 36 assay-sets. The diagnostic sensitivity for six assay-sets (1; 7B/C/40; 23A; 29; 33B and 35A/C/42) was lower (50–74%, Table 3) as the prevalence of the targeted serotypes detected by Quellung was ≤ 1% whereas additional targeted serotypes were detected using ‘Fluidigm’ qPCR (Fig. 3). The remaining assay-sets could not be assessed as explained above. The diagnostic specificity was high (> 95%) for all assay-sets where targeted serotypes were previously detected by Quellung (Table 3)./p> 0.05; Table 3). The ‘Fluidigm’ reaction-set was able to identify an additional 39.1% (826/2113) serotypes above those detected by culture for the compared assay-sets in Table 3, and conversely culture detected 132 (9.3% of 1419) serotypes not identified by ‘Fluidigm’ qPCR (Table 3, Fig. 3)./p> 0.98). Notably, the detection of additional serotypes (39.1%) by the ‘Fluidigm’ qPCR panel described here with 96 assay sets, is comparable to the ‘Fluidigm’ panel described previously (also 39.1%), that included 48 assay sets32. Compared with the gold-standard culture based-Quellung method, our reaction-set was 98.8% accurate for the classification of pneumococcal serotypes. Further, the average sensitivity across the qPCR reaction-set was 89.1% compared with Quellung./p>

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